本发明公开了一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,利用反相高效液相色谱法以及不同键合填料的色谱柱来检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度,以解决现有对Aβ-淀粉样多肽1-42纯度检测方法的局限性,为检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度提供更多的途径。其检测条件为:色谱柱:C4硅胶柱,C8硅胶柱;流动相:A相:甲酸水溶液,B相:甲酸乙腈溶液,C4柱0到25分钟A∶B由90∶10到40∶60;C8柱0到25分钟A∶B由85∶15到35∶65;流速:1ml/min,波长:220nm,样品浓度:0.1mg-0.2mg/0.1ml,上样量:0.1-0.2mg。本发明无论在色谱柱的选择上还是流动相的试剂上,都是很容易得到的,成本低,操作方便,更能达到检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯品纯度的目的。
1.一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,其特征是包括如下步骤:将Aβ-淀粉样多肽1-42用超纯水超声溶解至完全,再用滤膜过滤,取滤液待用;利用反相高效液相色谱法,对滤液进行检测,其检测条件是:色谱柱:C4硅胶柱,C8硅胶柱,xa0流动相:A相:甲酸的水溶液,B相:甲酸的乙腈溶液,xa0C4柱xa0xa0时间minxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Axa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Bxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa090%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa010%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa025.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa040%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa060%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa030.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa090%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa010%xa0C8柱xa0xa0时间minxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Axa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Bxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa085%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa015%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa025.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa035%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa065%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa030.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa085%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa015%流速:1ml/min,波长:220nm。
2.根据权利要求1所述的一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,其特征是:所述C4硅胶柱尺寸为:5um,4.6×250mm。
3.根据权利要求1所述的一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,其特征是:所述C8硅胶柱尺寸为:5um,4.6×250mm。
4.根据权利要求1所述的一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,其特征是:所述A相是含体积浓度为0.05-0.1%甲酸水溶液,所述B相是体积浓度为0.05-0.1%甲酸乙腈溶液。
5.根据权利要求1所述的一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,其特征是:步骤2)中C4柱的流动相梯度选择0到25minxa0A:B由90:10到40:60。
6.根据权利要求1所述的一种检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的方法,其特征是:步骤2)中C8柱的流动相梯度选择0到25minxa0A:B由85:15到35:65。技术领域
本发明涉及一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,特别涉及一种利用反相高效液相色谱法以及不同键合填料的色谱柱来检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer"sDisease,AD)是一种发病率高、危害极大的中枢神经系统退行性疾病,主要临床症状是智力进行性减退,特征性病理学改变是老年斑,神经元纤维缠结,以海马、皮层区域为主的神经元数目减少。β-淀粉样多肽1-42(Amyloidβ1-42xa0peptide,简称Aβ42)是存在于阿尔茨海默病患者脑组织中的特异病理改变之物,同时它在AD患者的脑积液及血浆中有所改变。研究表明Aβ-淀粉样多肽1-42在脑内的沉积是阿尔茨海默病的主要原因,因此纯品Aβ-淀粉样多肽1-42对阿尔茨海默病的病理研究有非常重要的作用。xa0目前对Aβ-淀粉样多肽1-42的药理研究也已有多种测定方法,如酶联免疫吸附测定法(ELISA),放射免疫分析法(RIA)或免疫放射分析法(Immunoradiometriassayxa0IRMA),Western印迹法(Westernxa0Boltting)免疫沉淀法(Immunoprecipi-tation)和免疫组织化学法(Immunohistochemical,IHC),各种不同检测方法的选择和应用,主要取决于实验研究的要求和目的。以上所有方法的建立是由于制备出了灵敏度高,特异性强和准确性好的Aβ-淀粉样多肽1-42,而对利用HPLC反相高效液相色谱法制备出来的Aβ-淀粉样多肽1-42进行纯度的检测就显得尤为重要。xa0对利用HPLC反相高效液相色谱法制备出来的Aβ-淀粉样多肽1-42的检测,目前多数都是利用TFA体系和以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料(PLRP-S柱)居多,由于PLRP-S柱特殊的不耐压特点,为此所得到的Aβ-淀粉样多肽1-42不但色谱峰形不对称而且所得到的理论纯度与实际纯度差异比较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用反相高效液相色谱法检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的方法,主要解决现有检测方法中以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料不耐压导致理论纯度与实际纯度差异比较大,以及对色谱柱以及缓冲盐的选择局限性的技术问题。为实现上述目的,本发明的技术方案如下:一种Aβ-淀粉样多肽1-42纯度的检测方法,包括如下步骤:1)xa0xa0将Aβ-淀粉样多肽1-42用超纯水超声溶解至完全,用滤膜过滤,取滤液待用。2)xa0xa0利用反相高效液相色谱法,对滤液进行检测,其检测条件是:色谱柱:C4硅胶柱,xa0C8硅胶柱,流动相:A相:甲酸的水溶液;xa0B相:甲酸的乙腈溶液xa0C4柱xa0xa0时间(min)xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Axa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Bxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa090%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa010%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa025.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa040%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa060%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa030.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa090%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa010%xa0C8柱xa0xa0时间(min)xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Axa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0Bxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa085%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa015%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa025.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa035%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa065%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa030.00xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa085%xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa015%上述%是质量百分浓度,流速:1ml/min,波长:220nm。更为优选的方案是Aβ-淀粉样多肽1-42与超纯水添加比例1-2:1(mg:ml),进一步优选为1:1(mg:ml),Aβ-淀粉样多肽1-42上样量通常为0.1-0.2mg。更为优选的方案是:所用C4硅胶柱尺寸为:5um,4.6×250mm(I.D)。更为优选的方案是:所用C8硅胶柱为尺寸:5um,4.6×250mm(I.D)。更为优选的方案是:所用的流动相的体系是含体积浓度为0.05-0.1%甲酸水溶液和体积浓度为0.05-0.1%甲酸乙腈溶液。更为优选的方案是:所用的流动相中C4柱B相的质量百分比浓度为10-60%。更为优选的方案是:所用的流动相中C8柱B相的质量百分比浓度为15-65%。更为优选的方案是:步骤2)中C4柱的流动相梯度选择0到25minxa0A:B由90:10到40:60。步骤2)中C8柱的流动相梯度选择0到25minxa0A:B由85:15到35:65。 色谱条件的选择 1.流动相的选择目前常用的Aβ-淀粉样多肽1-42纯度检测的流动相体系是体积浓度为0.1%的三氟乙酸体系和PLRP-S柱的结合,其检测出来的色谱峰很宽,不能形成很好的对称色谱峰形。也选用其它经常检测多肽的体系进行相关的实验,如:醋酸胺缓冲液体系,甲酸体系。这三种体系对Aβ-淀粉样多肽1-42分离效果基本差不多。而本发明的甲酸色谱条件下Aβ-淀粉样多肽1-42的峰形稍微比较对称一些,并且甲酸体系也比较容易配置得到。2.色谱柱的选择Aβ-淀粉样多肽1-42的性质及序列使它在色谱柱中极易造成峰形扩散,一般的以硅胶基质为的C18键合相填料基本无法使峰聚集而在色谱柱中出现很好的色谱峰,所以目前多数选择使用以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料(PLRP-S柱),因为其有很好的聚合性,所以用此填料的色谱柱检测Aβ-淀粉样多肽1-42纯度居多。但是聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物又存在一定的缺点,就是聚合物色谱柱的柱效比较低,分离效果比较差,主要是由于以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料不耐压,对装此填料的装柱技术要求极高不仅装柱困难,而且所装出来的色谱柱的理论塔板数也比较低。故此本发明选择键合填料为C4货C8的色谱柱,一方面是由于键合填料为C4或C8的色谱柱的孔径不仅大于普通C18的色谱柱孔径,而且对于疏水性的分子量稍大的蛋白在一定程度上也有比较好的聚合性;另一方面,C4或C8的键合填料其耐压程度远远高于聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料,所以其装柱出来的色谱柱柱效高,分离效果好。3.梯度的选择针对Aβ-淀粉样多肽1-42峰形易扩散的特点,不管是以聚苯乙烯-聚乙烯基苯为基质的聚合物树脂填料色谱柱还是以键合填料为C4或C8的色谱柱,我们在梯度的选择上都是选用较宽的梯度作为Aβ-淀粉样多肽1-42的检测梯度条件。由于C4和C8其碳链长度的不同的,Aβ-淀粉样多肽1-42在C4和C8色谱柱上的保留强弱有一些区别,在C8色谱柱的保留时间比在C4色谱柱上的保留时间更久一些,所以C4色谱柱的梯度选择为B相的质量百分比浓度10-60%,C8色谱柱的梯度选择为B相的质量百分比浓度15-65%。本发明的有益效果是:解决了现有对Aβ-淀粉样多肽1-42纯度检测方法的局限性,利用甲酸体系和键合填料为C4和C8的条件,不仅能解决Aβ-淀粉样多肽1-42色谱峰形不对称的缺点,而且也大大减小了理论纯度与实际纯度的误差。此方法的建立为利用HPLC反相高效液相色谱法制备出来的Aβ-淀粉样多肽1-42进行纯度的检测提供了更多更方便可靠的检测途径。大部分对Aβ-淀粉样多肽1-42检测色谱柱都使用的是PLRP-S(刚性聚合物色谱柱),而本发明使检测方法不仅在体系上,而且在色谱分析柱上都有了更多样的选择。
附图说明
图1为PLRP-S填料色谱柱在TFA体系下的检测图。xa0图2为PLRP-S填料色谱柱在甲酸体系下的检测图。xa0图3为C4键合相填料色谱柱甲酸体系下的检测图。xa0图4为C8键合相填料色谱柱甲酸体系下的检测图。
具体实施方式
实施例1 xa0xa0xa01.样品处理:称取0.1mg的Aβ-淀粉样多肽1-42,用0.1ml的超纯水超声溶解至完全,用0.45um的滤膜过滤,取滤液待用。xa02.色谱检测条件:日本岛津液相色谱仪(型号:LC-10AVP,高压双泵,紫外检测器),岛津N2000工作站。流动相:A相:体积浓度为0.1%三氟乙酸的水溶液,B相:体积浓度为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,梯度:xa00到25分钟A:B由90:10到50:50;流速:1ml/min;波长:220nm;色谱柱:PLRP柱,10um,4.6×250mm(I.D);进样量:0.1mg/0.1ml,5ul。xa0xa0xa03.通过色谱仪的紫外检测吸收得PLRP-S填料色谱柱在TFA体系下的检测图(图1)。 实施例2 xa0xa0xa01.样品处理:称取0.1mg的Aβ-淀粉样多肽1-42,用0.1ml的超纯水超声溶解至完全,用0.45um的滤膜过滤,取滤液待用。xa02.色谱检测条件:日本岛津液相色谱仪(型号:LC-10AVP,高压双泵,紫外检测器),岛津N2000工作站。流动相:A相:体积浓度为0.1%三氟乙酸的水溶液,B相:体积浓度为0.1%三氟乙酸的乙腈溶液,梯度:xa00到25分钟A:B由90:10到50:50;流速:1ml/min;波长:220nm;色谱柱:PLRP柱,10um,4.6×250mm(I.D);进样量:0.1mg/0.1ml,5ul。xa0xa0xa03.通过色谱仪的紫外检测吸收得PLRP-S填料色谱柱在甲酸体系下的检测图(图2)。 实施例3 xa0xa0xa01.样品处理:称取0.1mg的Aβ-淀粉样多肽1-42,用0.1ml的超纯水超声溶解至完全,用0.45um的滤膜过滤,取滤液待用。xa02.色谱检测条件:日本岛津液相色谱仪(型号:LC-10AVP,高压双泵,紫外检测器),岛津N2000工作站。流动相:A相:体积浓度为0.05-0.1%甲酸的水溶液,B相:体积浓度为0.05%-0.1%甲酸的乙腈溶液,梯度:xa00到25分钟A:B由90:10到40:60;流速:1ml/min;波长:220nm;色谱柱:C4柱,5um,4.6×250mm(I.D);进样量:0.1mg/0.1ml,5ul。xa0xa0xa03.通过色谱仪的紫外检测吸收得C4填料色谱柱在甲酸体系下的检测图(图3)。 实施例4 xa0xa0xa01.样品处理:称取0.1mg的Aβ-淀粉样多肽1-42,用0.1ml的超纯水超声溶解至完全,用0.45um的滤膜过滤,取滤液待用。xa02.色谱检测条件:日本岛津液相色谱仪(型号:LC-10AVP,高压双泵,紫外检测器),岛津N2000工作站。流动相:A相:体积浓度为0.05-0.1%甲酸的水溶液,B相:体积浓度为0.05%-0.1%甲酸的乙腈溶液,梯度:xa00到25分钟A:B由90:15到35:65;流速:1ml/min;波长:220nm;色谱柱:C8柱,5um,4.6×250mm(I.D);进样量:0.1mg/0.1ml,5ul。xa0xa0xa03.通过色谱仪的紫外检测吸收得C8填料色谱柱在甲酸体系下的检测图(图4)。